EXERCICE

Faculté des Sciences Semlalia
STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES
TD I et TD II
NB : Il est vivement conseillé de résoudre les différents exercices avant
de se présenter en salle de TD. Les réponses données à la fin du document
vous sont fournies pour vous permettre de vérifier la justesse de votre
raisonnement. Faites un effort personnel avant de les consulter. EXERCICE 1
Le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) est le coenzyme de
nombreuses déshydrogénases.
A- Calculer l'absorbance à 340 nm et à 260 nm d'une solution de NADH à 0,05
g/litre, placée dans une cuve dont le trajet optique est de 1 cm.
PMNADH = 709 g/mol
? NADH (à 340 nm) = 6 220 M-1cm-1
? NADH (à 260 nm) = 15 400 M-1cm-1 B- Au cours d'une manipulation, l'expérimentateur réalise 5 ml d'un mélange
NADH/NAD+ mais oublie de noter les concentrations respectives sur le
flacon. Pour trouver ces valeurs, il effectue des mesures au
spectrophotomètre avec une cuve de 1 cm de trajet optique :
DO340nm = 0,44
DO260nm = 1,31
Quelles sont les concentrations en NADH et NAD+ dans le mélange sachant
que :
? NAD+ (à 340 nm) = 0 M-1cm-1
? NAD+ (à 260 nm) = 15 400 M-1cm-1
EXERCICE 2
Au niveau d'une cellule de mammifère, le poids moléculaire du DNA nucléaire
natif est de 9.1011 daltons. A- Quelle est la longueur en pb et en mètre de ce DNA associé en double
hélice (forme B) ? B- L'analyse de la composition en base de ce DNA permet de déterminer le
rapport A/G=4. Donner le pourcentage de chaque base pour ce DNA. C- Connaissant la Tm du poly-d-AT (69,3°C) et du poly-d-CG (110°C), Quelle
sera, dans les mêmes conditions expérimentales, La Tm de ce DNA ?
EXERCICE 3
A- Classer les molécules de DNA bicaténaire a, b et c par ordre croissant
en fonction de leur température de fusion. Il s'agit de molécules
constituées de la répétition des séquences suivantes : a) AAGTTCTCTGAA
b) GGACCTCTCAGG
c) AGTCGTCAATGC EXERCICE 4
Les deux molécules A et B sont dénaturées et renaturées par chauffage puis
refroidissement lent. Quelle est celle qui formera le plus souvent la
molécule d'origine. ATATATATATATATATATATATATATATATA
TATATATATATATATATATATATATATATAT TAGCGGATGCTTCAATGCTATCCGTCAGCAT
ATCGCCTACGAAGTTACGATAGGCAGTCGTA EXERCICE 5
On considère les DNA L, M et N. L et M ont une taille de 647 pb. L résiste
aux exonucléases mais non M. Enfin, N est linéaire, mesure 0,3 ?m et a un
PM de 291 000 daltons. A- Regrouper sur un tableau les diverses caractéristiques des DNA L, M et
N : conformation (linéaire ou circulaire ; simple ou double brin, PM,
longueur en ?m et nombre de nucléotides. B- On chauffe L et M et on mesure leur absorbance à 260 nm. On obtient
l'enregistrement ci-dessous. Expliquer la différence qui existe entre les
deux profils à une température < 50°C. Interpréter les augmentations de la
densité optique. Déterminer approximativement la Tm de L et M. En quoi
diffèrent les DNA L et M ? C- Une solution N1 du DNA N a une absorbance de 2,8 à 25°C. En mélangeant
2,5 ml de N1 à 7,5 ml d'eau, on obtient la solution N2. Tracer sur le
graphe précédent la courbe correspondant à N2. EXERCICE 6
Deux segments de DNA A et B ont la même taille (10 000 paires de bases) et
contiennent chacun 1000 paires de bases (G+C).
Pour le segment A, les paires de bases (G+C) sont groupées au niveau de
l'une des deux extrémités du DNA. Pour B, elles sont réparties de façon
homogène le long du segment de DNA.
Que donnera l'analyse de ces deux DNA : (Justifier votre réponse).
A- Par centrifugation isopycnique.
B- Par analyse de leur courbe de dénaturation ? Tracer les courbes en
utilisant la relation : Tm=69,3+0,41(%G+C)
EXERCICE 7
A et B sont deux DNA de 6 kpb. Après électrophorèse en gel d'agarose, on
obtient le profil n°1. Si A et B sont préalablement soumis à l'action de
l'endonucléase de restriction BamH I, le profil électrophorétique devient
le profil n°2. (Précision : une endonucléase de restriction est un enzyme qui opère une
coupure spécifique sur le DNA double brin au niveau d'une séquence
bien déterminée) A- Commenter ces résultats. B- Donner le profil qui serait obtenu si on fait agir une exonucléase avant
l'électrophorèse. C- Donner le profil électrophorétique qui serait obtenu si on fait agir une
autre endonucléase de restriction pour laquelle chacune des molécules (A et
B) possède deux sites de coupure distants de 4000 pb.
EXERCICE 8
Dans le but de caractériser un acide nucléique inconnu, on réalise les
expériences suivantes : a) l'étude de la variation de l'absorbance à 260 nm en fonction de la
température -entre 20°C et 90°C- fait apparaître une brutale
augmentation d'absorbance autour de 75°C suivie d'une stabilisation.
L'effet hyperchrome observé est de 30%. Si l'échantillon est
brutalement refroidi, l'absorbance diminue peu. b) Après centrifugation en gradient de CsCl, l'acide nucléique natif
conduit à l'obtention d'une seule bande correspondant à une densité de
1,77g/cm3 alors que l'échantillon provenant de l'expérience précédente
fournit lui aussi une seule bande mais de densité 1,72g/cm3.Par
ailleurs, des mesures d'absorbance à 260 nm mettent en évidence que la
bande de densité 1.72g/cm3 contient seulement la moitié du matériel
présent dans la bande de densité 1.77g/cm3 c) Le contenu du tube de centrifugation contenant la bande de densité
1.72g/cm3 est remélangé longuement à une température de l'ordre de
60°C puis recentrifugé. On retrouve alors une seule bande de densité
1.77g/cm3 et contenant presque tout le matériel de départ.
d) La centrifugation en gradient de CsCl est maintenant réalisée sur un
échantillon de l'acide nucléique de départ placé en milieu alcalin (pH
12) pendant 1 heure puis ramené à pH7. On retrouve alors une bande de
densité 1.72g/cm3 même si l'on refait l'expérience (c) sur le contenu
du tube. Interpréter les résultats obtenus à l'issue de chacune de ces expériences.
Que peut-on dire de la structure de l'acide nucléique natif?
EXERCICE 9
Un oligonucléotide subit une hydrolyse alcaline complète. L'hydrolysat
contient :
2 Gp, 2 Cp, 3 Ap et 2 Up. L'oligonucléotide est traité par différentes nucléases : a) La ribonucléase pancréatique conduit à un trinucléotide renfermant les
bases A, C et G et 3 dinucléotides : l'un contient G et U, l'autre A
et C et le troisième A et U.
b) L'action de la ribonucléase T1 libère Gp, un trinucléotide renfermant
A, C et G et un pentanucléotide.
c) Après action d'une 3'-monophosphoestérase qui détache un groupe
phosphate, l'oligonucléotide est mis en présence de la
phosphodiestérase de venin de serpent pendant une courte durée :
l'hydrolysat contient de l'uridine-5'-phosphate.
d) Après action de courte durée sur l'oligonucléotide, la
phosphodiestérase de la rate conduit à de la guanosine-3'-phosphate. Donner la séquence en bases de l'oligonucléotide. |ENZYME |SPECIFICITE DE COUPURE |
|Ribonucléase pancréatique (RNase|5'??PYp?N??3' |
|A) | |
|RNase T1 |5'??Gp?N??3' |
|3'-Monophosphoestérase |Suppression de l'acide phosphorique du|
| |côté 3' |
|Phosphodiestérase de venin de |3' exonucléase |
|serpent | |
|Phosphodiestérase de la rate |5' exonucléase |
EXERCICE 10
Une même quantité de DNA double brin d'un virus est complètement hydrolysée
par différentes enzymes de restriction utilisées seules (digestions
simples) ou conjointement (digestions doubles). Après séparation par
électrophorèse en gel d'agarose, la taille des fragments générés est
estimée (tableau ci dessous). Etablir la carte des sites de restriction. |Enzymes utilisées |Tailles des fragments en Kpb |
|BamH I |6 et 12 |
|Hind III |6 et 12 |
|Sal I |2 et 16 |
|BamH I + Hind III |6 |
|BamH I + Sal I |2, 6 et 10 |
|Hind III + Sal I |2, 4 et 12 |
EXERCICE 11
La structure primaire du DNA ci-dessous (DNA matrice) a été déterminée par
la méthode de Sanger. 5' TACCATGGTTAAGCTGCCGAT 3' A) donner la séquence du brin complémentaire de ce DNA. B) Donner le schéma de la plaque d'électrophorèse obtenue expérimentalement
et qui a permis de conclure à la séquence ci-dessus (justifier la
réponse). C) Donner, en justifiant, la structure de ce fragment de DNA double brin
sachant que la séquence ci-dessus appartenait à un DNA double brin obtenu
lors de l'attaque de l'extrémité d'un DNA linéaire par l'enzyme de
restriction BbvI qui reconnaît le site : 5' ?? GCAGC(N) 8? ?? 3'
3' ?? CGTCG(N)12? ?? 5'
BbvI coupe le DNA :
8 nucléotides à droite du site sur le brin [5' ?? GCAGC ?? 3'] et
12 nucléotides à droite du site sur le brin complémentaire [3' ??
CGTCG ?? 5']
EXERCICE 11 (PCR)
On veut effectuer une a