II. Ségrégation digénique dans le cas de la liaison physique - Free

Analyse génétique
Table des matières
I. Les bactéries 2 A. Croissance en liquide 2 B. Croissance sur boite 3 C. Caractéristiques de la croissance sur bactéries 3 1. Recherche des mutants 3 II. La recombinaison chez les bactéries 5 III. Le facteur F présent dans les cellules donneuses 6 A. Découverte des Hfr 7 1. Origine des Hfr 7 2. Quand une Hfr rencontre une F- 7 3. La cartographie génétique des bactéries par les expériences de
conjugaison interrompue. 8 I. la transformation bactérienne 12 II. Transfert de gènes : la transduction 13 I. Le cycle du phage T4 15 II. Génétique des phages 16 A. Les travaux de Benzer : détermination de la structure fine du gène 17 B. Seymour Benzer : le test cis-trans 18 I. L'analyse des tétrades 19 A. Cycle haplodiplobiontique de la levure 19 B. Cycle haplobiontique de Neurospora 19 II. Ségrégation digénique dans le cas de la liaison physique 21 A. Origine des différentes tétrades : 22 B. Pour déterminer la distance entre 2 gènes 22 III. Ségrégation digénique dans le cas d'indépendance physique 22 A. Origine des différents tétrades 23 B. Analyse des tétrades 24 I. La liaison génétique 25 II. Les cartes génétiques 26 A. Exemple des tests 2 points 26 B. Cartographie à partir d'un croisement avec trois marqueurs 26 1. Détermination de l'ordre des gènes 26
Chapitre 1 : La génétique bactérienne Jacob et Moneau ont démontré qu'il existe des gènes chez les bactéries. Ils
ont eu un prix Nobel pour avoir montré qu'il y avait des gènes de
régulation. La génétique bactérienne permet la mise en place de l'ingénierie des
bactéries, pour leur faire produire des molécules, par exemple pour faire
des vaccins. On est aujourd'hui capable de modifier l'ADN des bactéries
pour leur faire produire la molécule voulue.
Les bactéries Elles sont partout, aérobies et anaérobies, leur taille est de 1µm, les
cellules animales font entre 10 et 100 µm (La plus grosse cellule naturelle
est l'?uf d'autruche). On peut regarder les bactéries en milieu liquide ou
étalées en colonies sur des boites de Pétri. Elles peuvent vivre dans des
conditions extrêmes, en s'adaptant. C'est cette adaptation que l'on utilise
pour faire des amplifications d'ADN. Ces organismes ont un génome circulaire. Celui d'E. coli mesure 4,5.106
paires de bases. Le génome humain mesure 3,3.109 paires de bases. Le nombre
de gènes d'un génome de mammifères fait 20 à 25 000 gènes. E. coli en fait
4 000. Le point essentiel de la manipulation d'E. coli est que sa croissance est
rapide. Le doublement de population se fait en 20 minutes. Une bactérie en
redonne un million en moins de 7 heures. La croissance peut se faire en haute densité, jusqu'à 109 à 1010 bactéries
par mL.
1 Croissance en liquide La croissance en liquide est utilisée pour la production de biomasse, dans
un fermenteur. La croissance peut être suivie en utilisant un
spectrophotomètre. L'étalonnage entre DO et nombre d'individus peut se
faire en utilisant la dilution en série et des étalements sur boite. La croissance présente 3 phases : 1) Phase de latence 2) Phase exponentielle : c'est là que les bactéries sont en bonne santé 3) Phase stationnaire : milieu épuisé, les bactéries s'arrêtent de
croitre, plus assez de nutriments 1 2 3
2 Croissance sur boite L'intérêt est que l'on peut étudier des millions de bactéries, et on peut
le faire en 12 heures. On ne peut pas, par exemple, faire ça avec des
mouches. On dit que seule la génétique bactérienne est capable de mettre en
place les cribles les plus puissants. Une colonie représente environ 107 cellules. On fait des clonages.
3 Caractéristiques de la croissance sur bactéries 2 termes à retenir : . Prototrophe : apte à croitre sur un milieu minimum . Auxotrophe : apte à croitre sur un milieu supplémenté par des
substances non requises pour la croissance du sauvage. Le taux de mutation des gènes est variable d'un gène à l'autre. En
générale, on a 1 mutant pour 105 individus à 1 pour 107. Mais il existe
aussi des cas particuliers, qui mutent à 1/100. Pour isoler des mutants, la
technique la plus souvent employée est la technique des répliques.
1 Recherche des mutants - Crible négatif : pour la plupart des auxotrophies, les mutants
d'auxotrophie qui nécessitent quelque chose pour croitre. On n'a pas
les moyens de sélectionner le mutant. - Crible positif : opposé au crible négatif. Par exemple, la résistance
aux antibiotiques. Ici, on sélectionne le mutant. Exemple : on cherche des mutants résistants à la streptomycine.
Classiquement, la population est sensible. Donc de bactéries sensibles on
veut aller vers des résistantes. De plus, on étudie des bactéries qui
nécessitent de l'arginine pour croitre, et on veut des bactéries qui n'en
ont pas besoin. Le premier est un crible positif, le second est négatif. En effet, pour la streptomycine, on met 108 bactéries sur boite de pétri,
et on rajoute de la streptomycine. Seuls les mutants résisteront, et donc
on les aura directement. Pour le second, on prend une boite avec milieu minimal + arginine, et on
met des bactéries. On met du velours là dessus, pour prendre quelques
bactéries de chaque colonie, puis on les réplique sur milieu minimum sans
arginine. On va obtenir des colonies, et pour chaque colonie du milieu
minimum, on prendra son homologue sur la première boite, elle sera arginine-
. 2ème exemple, on a des Gal+, on cherche des Gal-, par un crible négatif. On
va faire une culture en milieu minimal + Glu, et on réplique sur milieu
minimal + Gal. Puis idem, homologues. On essaie de favoriser le crible positif car il est plus facile à utiliser. [pic] [pic] 90% de l'ADN représente des régions
codantes (Chez les eucaryotes, environ
1% est codant). Les nombres du schéma
sont les minutes d'un protocole. Les bactéries sont bourrées de petits ADN circulaires, qui font de 4000 à
100 000 paires de bases, leur réplication se fait par des protéines de
cellule hôte. On note que c'est lui qui contient les gènes de résistance
aux antibiotiques. La résistance permet de suivre un antibiotique. On peut retracer l'histoire d'un plasmide par ses gènes, ils peuvent sauter
d'une espèce à l'autre.
La recombinaison chez les bactéries Comment les gènes sont-ils organisés chez les bactéries ? Expérience de Laderberg et Tatum (1946) Le mélange a des
bactéries qui poussent, et
donc on a des bactéries
prototrophiques. Il y a donc
eu un échange d'informations
entre A et B. Y a-t-il besoin d'un contact physique ? Il n'y a rien qui pousse avec
seulement échanges, pas de
contact, donc les contacts
sont nécessaires. W. Hayes montre que le transfert de l'information est unidirectionnel. Pour
ça, il reprend le même système que Laderberg, puis il l'inverse. Ensuite il
mélange. Il traite alors à la streptomycine, tuant la souche A, et gardant
la souche B. Il obtient des prototrophes. Après inversion et traitement, il
n'y a pas de prototrophes. Donc la souche A ne fait que donner les informations, alors que la souche B
ne le fait pas. A a donné l'info avant de mourir, et prototrophes. Dans le
2ème cas, B ne donne pas l'information, meurt, et donc pas de prototrophes.
A est donc donneur, et B receveur. Il y a de grandes différences entre donneur et receveur. Le donneur, mâle
est recouvert de poils, et quand il rencontre une E. coli non poilue,
femelle, il forme un pont cytoplasmique et transmet l'information.
Le facteur F présent dans les cellules donneuses Les bactéries donatrices contiennent un épisome, un plasmide nommé le
facteur F. Il est impliqué dans une différenciation male/femelle, il est
responsable de l'échange, il est autonome en réplication (Il ne va pas se
dupliquer en même temps que la bactérie). Il peut donc être perdu lors de
la réplication. Il contient une origine de réplication, et une seule, il est donc autonome
en réplication (ne pas l'oublier sur un dessin), les gènes de transfert de
matériel génétique, des gènes qui permettent la différenciation des pilis,
et la « pairing region » (= région d'appariement), c'est une région du
facteur F qui se retrouve sur les chromosomes. Le chromosome est
circulaire, le plasmide est circulaire, et donc on peut intégrer le
plasmide dans le chromosome. On peut se demander ce qu'il se passe quand on a ce pont cytoplasmique,
quand la F+ rencontre la F-. C'est le transfert du facteur F. F+ rencontre
F-, elle l'agrippe, et forme le pont cytoplasmique. A ce moment, le facteur
F va envoyer une copie dans la bactérie réceptrice. Le facteur F est donc
répliqué, transféré dans un seul sens, il se referme, et on obtient au
final 2 bactéries F+, la F- devient F+. Le pont est rompu, l'ancienne F- a
les poils qui poussent. Pourquoi existe-t-il encore des