eot 1994.doc - Lyon

EPREUVE PROFESSIONNELLE DE SYNTHESE

1ère partie : Etude d'opérations techniques

L'usage d'un dictionnaire anglais-français est autorisé.

PRÉPARATION D'UN TEST DE DEPISTAGE DES ENTEROTOXINES STAPHYLOCOCCIOUES DANS
LES ALIMENTS

La recherche des entérotoxines staphylococciques revêt un grand intérêt en
microbiologie alimentaire.
Produites au cours de la croissance dans les aliments par certaines souches
de Staphylococcus aureus entérotoxinogènes, ces toxines, dont il existe
sept sérotypes (A, B, C1, C2, C3, D, E), sont à l'origine de toxi-
infections alimentaires (TIA).

Leur recherche est intéressante quand l'analyse microbiologique est mise en
défaut, qu'il s'agisse d'un produit impliqué dans une TIA ou de l'étude de
la qualité hygiénique d'un produit à diverses étapes de sa fabrication.

Le test de dépistage qu'on se propose de préparer est un test
immunoenzymatique.

Les étapes principales de son élaboration sont les suivantes :




















1. PRODUCTION DES ENTEROTOXINES EN FERMENTEUR (12 points)


Elles sont produites, in vitro, en quantité appréciable dans des
conditions particulières indiquées dans le document 1.


1. Justifier l'étape préalable à l'inoculation du fermenteur.

2. Quelle est la nature des deux composés niacine (acide nicotinique) et
thiamine ? Quel rôle jouent-ils ?

3. Quelles sont les régulations assurées dans ce procédé ?
4. Quelle fraction sera récupérée lors de l'étape terminale ? Justifier
la réponse.

5. Des expériences préliminaires au choix du milieu de production ont
été réalisées en fermenteur, sous conditions contrôlées de pH et
d'aération, en présence et en absence de glucose.

1. Commenter les résultats présentés sur le document 2.


2. Justifier la composition du milieu de production de
l'entérotoxine.

2. PURIFICATION DES ENTEROTOXINES STAPHYLOCOCCIQUES (32 points)

Ce sont des holoprotéines thermostables, de masse molaire comprise entre
26000 et 30000 daltons, de pHi compris entre 7 et 8,6.
Le suivi de la purification de l'entérotoxine est réalisé par une méthode
d'immunodiffusion. Dans les fractions où elle a été ainsi détectée, sa
concentration est déterminée par la méthode de LAURELL.

1. Les étapes de la purification de l'entérotoxine D sont indiquées sur
le document 3.


1. Quelle masse d'entérotoxine est obtenue en fin de purification ?


2. Que représentent, à chaque étape, les paramètres suivants
- pureté,
- rendement par rapport à la solution I.

3. Quelle est l'étape de purification la plus performante ?
Justifier.

2. Etude de l'étape II de purification.

1. Ecrire la formule semi-développée d'une carboxyméthylcellulose. A
quelle catégorie de résine appartient-elle ?

2. Interprétation du diagramme d'élution (document 4).

1. Quel est l'intérêt de la mesure de l'absorbance à 278 nm ?


2. A quoi correspond la fraction A ? Dans quelle(s) fraction(s)
se trouve l'entérotoxine ?

3. Quels sont les facteurs mis en jeu pour séparer les diverses
fractions ?

4. L'entérotoxine D a un pHi égal à 7,4. Comment expliquer son
élution de la résine ?

3. Dosage de l'entérotoxine obtenue en fin de purification.


1. Indiquer brièvement le principe de la méthode de LAURELL (électro-
immunodiffusion).
2. Afin de préciser les conditions opératoires, des essais préalables
ont été réalisés sur deux lames d'agarose (document 5, figure 1).
Dans le même temps des courbes standards ont été établies pour
différentes concentrations d'anticorps (document 5, figure 2).
A l'aide de ces données, analyser les résultats de la figure 1.

3. Préparation d'une lame d'agarose.

Déterminer le volume d'immunsérum à incorporer dans la gélose pour
être dans de bonnes conditions de lecture lors du dosage de ces
solutions antigéniques 1, 2 et 3.
On considère que la méthode est quantitative pour des fusées dont
la hauteur est comprise entre 1 et 5 cm.


4. Exploiter le tableau ci-dessous et déterminer la concentration
massique de l'entérotoxine contenue dans la fraction analysée.

| |Etalonnage |Dosage |
|Hauteur des fusées (mm) |12 |24 |36 |46 |31 |
|Quantité d'entérotoxine |2 |4 |6 |8 |x |
|(µg par puits) | | | | | |

Donnée : le volume d'entérotoxine déposé par puits est de 10 µL.


3. DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE DES ENTEROTOXINES STAPHYLOCOCCIQUES ET INTERET
EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE (36 points)

A partir des principaux sérotypes d'entérotoxines (A, B, C1 et D), des
anticorps monoclonaux monospécifiques sont élaborés in vitro et un sérum
polyspécifique (anticorps polyclonaux) est produit chez le lapin.

Ces anticorps permettent de développer une méthode ELISA indirecte de type
sandwich.

1. Etude du document 6.


1. A l'aide de ce document, schématiser les étapes du dosage.

2. Ecrire l'équation de la réaction enzymatique utilisée.

2. Intérêt de la méthode ELISA sandwich indirecte par rapport à la
méthode ELISA sandwich directe.


1. Schématiser le principe de la méthode ELISA sandwich directe.


2. De la technique directe ou indirecte, quelle est la plus sensible
? Justifier la réponse.

3. Du point de vue des réactifs utilisés, quel est l'avantage de la
technique indirecte ?
3. Lors de la mise au point de la méthode ELISA, le rapport
enzyme/anticorps pour le conjugué est important.
La concentration d'activité catalytique du conjugué est de 4 U.L-1 de
milieu réactionnel.
Le conjugué enzyme-anticorps est obtenu à partir d'un anticorps
purifié (IgG) et d'une préparation de peroxydase lyophilisée dont
l'activité spécifique est de 1050 U/mg.


1. En fonction des données précédentes et du mode opératoire utilisé
(document 7), déterminer la concentration massique en peroxydase
de la solution de conjugué.


2. Calculer le rapport massique enzyme/IgG dans ce conjugué.

Donnée : 1 unité (U) = 1 µmol de produit formé/min.


4. Intérêt du dosage en microbiologie alimentaire.


1. Méthode microbiologique : dénombrement des Staphylococcus aureus
dans un produit alimentaire.


1. 0,1 ml d'une crème non pasteurisée ont été étalée sur milieu
de BAIRD-PARKER mis à incuber 24 h à 37°C.
28 colonies noires sont dénombrées.
Trois colonies sur cinq donnent un résultat positif pour la
recherche de la coagulase.
- Donner le principe de la recherche de la coagulase et les
conditions opératoires de sa réalisation.
- Déterminer le nombre de Staphylococcus aureus présents dans
la crème.

2. Le critère appliqué à la plupart des denrées alimentaires est
de 102 Staphylococcus aureus/g ou ml.


Quels sont les résultats du dénombrement sur milieu de BAIRD-
PARKER lorsque le nombre de Staphylococcus aureus dans
l'échantillon est inférieur à 102 germes / g ou ml ?
On envisagera le cas d'un produit pur et d'un produit devant
d'abord être homogénéisé et dilué au 1/10.


2. Corrélation entre le dosage des entérotoxines dans les aliments et
la méthode microbiologique.
Le tableau présenté dans le document 8 rassemble des résultats
d'investigations faites à la suite de TIA dont les symptômes
correspondent à ceux provoqués par les entérotoxines
staphylococciques.
L'analyse microbiologique a été menée parallèlement à une
recherche directe des entérotoxines dans l'aliment (dosage
immunoenzymatique).
Lorsque l'analyse microbiologique est pratiquée seule, on
considère qu'un nombre supérieur à 105 germes/g suffit à confirmer
la responsabilité des Staphylococcus aureus dans la TIA
(production d'entérotoxine suffisante).

1. Quels sont les cas où il existe une corrélation entre analyse
microbiologique et recherche de l'entérotoxine ? Justifier la
réponse.


2. Quel est le cas où l'analyse microbiologique est mise en
défaut ?

3. Quelle(s) explication(s) peut-on proposer aux résultats du cas
d ?
DOCUMENT 1

ENTEROTOXIN PRODUCTION

The Staphylococcus aureus strain used for the production vas preserved on
porcelain beads.

Step 1. One bead vas placed in each of four 250 mL Erlenmeyer flasks
containing 50 mL of sterile medium composed of :

- 3 % aminoacide
- 3 % protein hydrolysate powder
- 10 mg/L niacin
- 0,5 mg/L thiamin
- carbohydrate = none

The medium is adjusted to pH 6,8.

Cultures were incubated at 37°C without shaking for 18 h.

Step 2. These cultures were aseptically inoculated into a fermenter
containing 20 L of sterilised medium.
The culture vas agitated at 500 rpm with an air flow of 20 L/min.
It was incubated at 37°C, pH 6,8, for 12-18 h.
Antifoam (Dow Corning Silicone B diluted 1 to 10) was added automatically
by peristaltic pump to con