4-3-1 La dénaturation de l'ADN - unBlog.fr

ECUE 2: Techniques d'analyse Génétique





Enseignants : ECUE 2
Dr N'NAN-ALLAOulo
Maître-Assistant Génétique
Spécialités : Biotechnologie et Conservation des
Ressources Génétiques



Dr COULIBALY Foungotin Hamidou
Expert auprès des Tribunaux (Test d'ADN,
Génétique)
Spécialités : Génétique Humaine
Biologie de la Procréation
Cytogénétique
Spermiologie
Essais Cliniques
Site web : www.crieafrique.net
E-mail : info@crieafrique.net










INTRODUCTION 3
1 Extraction/Purification des acides nucléiques 3
1-3 Dosage et conservation des acides nucléiques 5
1-3-1 Estimation des quantités d'ADN. 5
1-3-1-1 Méthode basée sur la fluorescence 5
1-3-2 Conservation des Acides nucléiques 6
2 Les enzymes agissant sur les acides nucléiques 6
2-1 Les enzymes de restriction 6
2-1-1 Généralités 6
2-1-6 Notion d'isoschizomères 8
2-1-7 Notion d'enzymes compatibles 9
2-2 Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction 10
3 Séparation des acides nucléiques 12
3-1 Electrophorèse 13
3-2 Ultracentrifugation 14
4 Détection, caractérisation et identification des acides nucléiques 15
4-1 Les sondes nucléotidiques 15
4-2 Marquage et suivi des acides nucléiques 16
4-2-1 Marquage radioactif 16
4-2-2 Marquages froids : fluorescence ; colorimétrie ;
chimioluminescence 17
4-3 Dénaturation de l'ADN et Hybridation moléculaire 18
4-3-1 La dénaturation de l'ADN 18
4-3-2 La renaturation ou l'hybridation 19
4-3-2-1-1 Southern Blot 20
- Carte de restriction de l'ADN. 21
4-3-2-1-2 Northern Blot 23
4-3-3 Dot Blot 23
4-3-4 Hybridation in situ (HIS) 23
4-3-2-1-3 Hybridation sur colonies 23
4-3-2-1-4 Hybridation sur chromosomes (FISH) 24
5 Amplification d'acides nucléiques 24
5-1 La PCR 24
5-1-2 Réalisation pratique 24
5-2 La RT-PCR 27




















INTRODUCTION

La biologie moléculaire est apparue au XXe siècle, à la suite de
l'élaboration des lois de la génétique, de la découverte des chromosomes et
de l'identification de l'ADN comme support de l'information génétique.
Au croisement de la génétique, de la biochimie et de la physique, la
biologie moléculaire est une discipline scientifique dont l'objet est la
compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule au niveau
moléculaire.
Le terme biologie moléculaire désigne également par extension l'ensemble
des techniques de manipulations d'acides nucléiques (ADN, ARN), appelées
aussi techniques de génie génétique.

1 Extraction/Purification des acides nucléiques


L'ADN (ou l'ARN) doit impérativement être purifié à partir de matériels
biologiques dans des conditions optimales de qualité et de quantité.
Le schéma général d'extraction de l'ADN se présente comme suit:
1- le broyage des tissus biologiques contenant l'ADN dans un tampon à pH
neutre ou légèrement basique
2- la séparation de l'ADN d'avec les autres composés solubles (protéines,
ARN, ...)
3- le dosage et la conservation de l'ADN


1. Extraction de l'ADN

Le procédé classique est l'extraction par le couple phénol-chloroforme. Le
phénol est un excellent agent dénaturant des protéines et il permet de
séparer efficacement les protéines et les acides nucléiques. Il est ensuite
éliminé par l'extraction avec du chloroforme (non miscible avec l'eau). La
séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par
centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucléiques. Des
traitements par des agents clivant les protéines (protéolyse) peuvent être
nécessaires. Les acides nucléiques peuvent être finalement récupérés sous
forme solide à la suite de précipitation par l'alcool éthylique ou par
l'alcool isopropylique. De nombreux réactifs sont disponibles, prêts à
l'emploi, ce qui permet de simplifier les opérations de purification. Il
est possible d'extraire les acides nucléiques à partir d'échantillons
biologiques variés: cultures cellulaires, tissus divers etc... Les méthodes
d'extraction doivent bien entendu être adaptées aux quantités disponibles
de matériel biologique.

1-1-1 Extraction de l'ADN à partir de tissus

Le broyage des tissus se fait dans des mortiers en céramique pour les
tissus à membrane cellulosique (comme les tissus végétaux) et dans des
tubes appropriés pour les cellules animales ou micro organiques. Dans
certains cas, on peut utiliser des broyeurs ou mixers adaptés. Le broyage
se fait en général, directement dans le tampon d'extraction. Cependant,
l'écrasement des tissus dans l'azote liquide avant de les suspendre dans le
tampon d'extraction (surtout pour les tissus végétaux ou les tissus durs
des animaux) permet de mettre les tissus sous forme de poudre et améliore
ainsi le taux d'extraction et la qualité de l'ADN extrait. Le broyage des
tissus lyophilisés se fait à sec avant de suspendre la poudre dans le
tampon d'extraction et peut avoir les mêmes avantages que l'utilisation de
l'azote liquide si le dessèchement des tissus se fait rapidement. Le tampon
d'extraction doit permettre de solubiliser les différents composants
cellulaires en protégeant l'ADN contre les nucléases (enzymes). Ce tampon
contient au minimum, un chélateur d'ions empêchant l'action des nucléases
(EDTA) et du sel pour maintenir la structure de l'ADN. On peut y rajouter
un détergent qui lyse les parois cellulaires (surtout pour les bactéries et
les cellules animales) et d'autres composés pour améliorer la qualité et la
quantité des acides nucléiques à extraire.

1-1-2 Extraction d'ADN à partir du sang

Faire éclater les globules rouges du sang par choc osmotique en le
mélangeant à une solution hypotonique. Récupérer des globules blancs par
centrifugation. Ajouter un mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de
protéinase K ; le détergent détruira les membranes et la protéinase
digérera les protéines associées à l'ADN. Extraire l'ADN des protéines par
un mélange phénol-chloroforme. Ajouter des sels pour augmenter la force
ionique puis précipitation de l'ADN par l'alcool éthylique absolu froid (-
20°C).

L'ADN précipite sous forme de filaments, visibles à l'?il nu, qui sont
récupérés par enroulement sur une baguette de verre. Re-dissoudre l'ADN
dans une solution tamponnée. L'ADN peut être ainsi conservé à 4°C plus d'un
an.

Remarque : la taille des fragments engendrés par les cassures mécaniques au
cours de cette extraction est supérieure à 20kB. Le rendement de cette
méthode est de quelques centaines de microgrammes d'ADN pour 10 à 20 ml de
sang. Attention : éviter de congeler l'ADN génomique, la congélation
provoquant de nombreuses cassures de la molécule.


2. Extraction des ARN

La stricte stérilité est recommandée à cause des RNases. Les milieux (eaux,
tampons, ...) et les matériels d'extraction doivent être autoclavés sous
haute pression. Les instruments ou matériels qui ne peuvent pas subir un
tel traitement doivent être lavées à l'acide iodoacétique 10 mM ou à l'eau
oxygénée puis rincées à l'eau autoclaveé. Porter des gants durant toute la
manipulation car les sécrétions humaines (sueur surtout) contiennent des
RNAses.

1-2-1 Extraction des ARN totaux

La méthode la plus sûre est la méthode de Chirgwin. Broyer le tissu dans un
homogénéisateur de Potter avec une solution adéquate (détergent SDS ou
Sarcosyl + un agent dissociant + une solution tampon + un agent réducteur).
Centrifuger l'homogénat pour éliminer les débris cellulaires.
L'extraction des ARN se fait : soit par précipitation différentielle de
l'ARN et de l'ADN / soit par ultracentrifugation sur coussin de chlorure de
césium (seul l'ARN peut, vue sa densité, traverser ce coussin et être
récupéré dans le culot
Laver l'ARN dans l'acétate de sodium et précipiter à l'alcool.
L'ADN est plus lourd que l'ARN.


1-2-2 Purification des ARNm à partir de ARN totaux

La majorité des ARNm eucaryotes possèdent une queue polyadénylée (polyA) à
son extrémité 3', utilisée pour purifier les ARNm par affinité.

Passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinité dont les sites de
fixation sont des oligonucléotides polydT ou polyU. Les ARN polyA sont
retenus alors que les ARNt et ARNr ne le sont pas. Eluer les ARNm et les
récupérer par précipitation par l'alcool éthylique absolu froid. On obtient
~50% d'ARN non polyA. Pour enrichir en ARN polyA, repasser sur la colonne.






1-3 Dosage et conservation des acides nucléiques


1-3-1 Estimation des quantités d'ADN.

Cette estimation est indispensable après extraction d'ADN à partir d'un
matériel biologique.
On a deux méthodes pour le dosage.


1-3-1-1 Méthode basée sur la fluorescence


Le principe est un fluorochrome qui se fixe sur le DNA et dont le taux de
fixation est directement lié a la quantité de DNA émettra une quantité de
fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de DNA présente.
o Les différents fluorochromes:
Se fixant spécifiquement sur des paires de bases:
Bases A-T: Hoechst 332 et DAPI
Bases G-C: mithramycine
o Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine orange
( qui ont l'avantage d'être moins chers )
Cette méthode nécessite un logiciel.


1-3-1-2 Méthode basée sur l