Partiel Correction Module : Chimie Analytique Page 1 ... - Promo 152

Le présent sujet comporte deux parties :
- Un exercice se rapportant à la quantification des espèces.
- Un QCM portant sur les questions relatives au cours magistral.


Les deux parties sont indépendantes. Lisez attentivement les textes.
N'oubliez pas de joindre vos feuilles de QCM et graphes à vos copies.

1°) Quantification de cannabinoïdes

Le cannabis, nom latin donné au chanvre, est cultivé principalement
au Pakistan, en Afghanistan, au Maroc, en Amérique Latine ...et sur nos
balcons. Son principe actif majoritaire, à effet psychotrope, est le (9
tétra hydrocannabinol (C21H30O2, noté THC), dont la teneur, suivant les
variétés, peut varier de 0,5 à 22%. Ses cibles sont deux récepteurs
cellulaires, CB1 et CB2, situées dans le cerveau. De manière aiguë, il
induit une tachycardie. Le rythme cardiaque redevient normal au bout de
24h, alors que l'aptitude intellectuelle reste affectée. Après inhalation
de fumée de cannabis, 18% du THC est absorbé et passe rapidement dans le
flux sanguin. Les concentrations plasmatiques sont alors de l'ordre de 8 à
10 µg/l pour une consommation isolée et de 50 à 200 µg/l pour un
consommateur régulier. Il est rapidement métabolisé par le cytochrome P450
2C9 en 11 hydroxy THC et en 8 hydroxy THC, substances également
psychotropes, à durée de vie courte, le 11 hydroxy THC s'oxydant en acide
11 nor (9 tétra hydrocannabinol (THC COOH) inactif. Ce dernier composé a
une durée de vie plus longue (> 5 jours et jusqu'à deux mois) et se
retrouve dans les urines, le sang, les cheveux, la salive....
La quantification de ces composés, par GC/MS, permet de savoir si un
individu est sous l'emprise de cannabis (applicable à d'autres stupéfiants)
et/ou si il est consommateur occasionnel ou régulier. Transportons nous
donc au laboratoire...

Principe analytique : Dans le cadre de cet exercice, nous nous
intéresserons uniquement à la quantification du THC. Les cannabinoïdes
présents dans l'échantillon à analyser sont extraits par adsorption sur une
membrane solide
(SPMEM : Solid Phase Micro-Extraction Membrane), désorbés par l'éthanol,
puis analysés par chromatographie en phase gazeuse (après dérivatisation
sous forme d'éthers silylés) couplée à une détection par spectrométrie de
masse. Un étalonnage interne est réalisé à partir d'un échantillon
référence de THC et d'un étalon interne le coumafuryl, noté EI.

1°) Préparations des étalons.

A partir d'une solution mère de THC, notée S0, à la concentration de
1mg/l, on prépare 5 échantillons de solutions étalons (solutions filles
dans l'éthanol) dans les conditions présentées dans le tableau ci-dessous

|S mère |V prélevé |V total |S fille |
| |(ml) |(ml) | |
|S0 |10 |100 |S1 |
|S1 |25 |50 |S2 |
|S2 |10 |20 |S3 |
|S1 |10 |50 |S4 |
|S2 |5 |25 |S5 |

Calculer, pour chacune des solutions 'filles' la concentration
(exprimée en ng/ml) en THC ainsi que le facteur de dilution par rapport à
la solution initiale.

2°) Préparation de la solution d'étalon interne :
A partir d'une solution mère d'étalon interne (E.I) à 200 mg l-1, on
prépare une solution d'étalon interne par dilution de 10 ml de solution
mère à 50 ml dans l'éthanol.

Calculer la concentration, en étalon interne, de la solution fille.

3°) Etalonnage interne

Dans un flacon vial de 2 ml, on introduit un volume de V1 de solution
étalon de THC, auquel on ajoute V2 de solution d'étalon interne et un
volume V3 d'agent de dérivatisation suivant le tableau :

|S étalon|V1 (µl) |V2 (µl) |V3 (µl) |Réf. |
| | | | |Echantillon |
|S1 |500 µl |250 µl |500 µl |A |
|S2 |500 µl |250 µl |500 µl |B |
|S3 |500 µl |250 µl |500 µl |C |
|S4 |500 µl |250 µl |500 µl |D |
|S5 |500 µl |250 µl |500 µl |E |



L'analyse des différents échantillons est réalisée par chromatographie
en phase gazeuse (CPG), dans les conditions suivantes :
Phase stationnaire : Colonne capillaire DB5 , L = 25 m, diam = 0,32 mm.
Film : 0,25 µm Phase mobile : Hélium
Débit : 1ml/mn (élution en mode isotherme) Injection : 1 µl
Ratio de Split :10/90
Détection : Spectrométrie de masse
On obtient les résultats suivants :

|Echantillon |Aire chromatographique |Aire chromatographique|
| |(THC) |(E.I) |
|E |13000 |62000 |
|D |29650 |61350 |
|C |60150 |59580 |
|B |127500 |64300 |
|A |253500 |57540 |

3a Sachant qu'il existe une relation linéaire entre la masse de
soluté injectée dans le chromatographe (mi) et l'aire du pic
chromatographique (Ai), Etablir la relation liant la concentration en THC
(dans les solutions étalons) et le rapport des aires chromatographiques
(ATHC / AEI).
3b Calculer les rapports ATHC / AEI) pour les différents échantillons
(A, B...E) et tracer la courbe d'étalonnage
CTHC = f(ATHC / AEI).
3c Que signifie le terme 'ratio de split'. Quel serait l'impact d'une
augmentation d'épaisseur de film sur la rétention des différents solutés.


4°) Préparation de l'échantillon

1 membrane (solide), pré activée, est mise au contact d'un
échantillon de 1 ml de sang fraîchement prélevé, pendant 30 mn (phase
d'adsorption). Elle est alors séparée de la phase liquide, séchée, puis
désorbée par 0,5 ml de solvant de désorption pendant 6 heures. La fraction
liquide, contenant le THC, est alors séparée de la fraction solide, volumée
à 1 ml avec de l'éthanol et est prête à être analysée par CPG.

5°) Quantification de l'échantillon analysé

Dans un vial de 2 ml, on introduit un aliquote de 500 µl de
l'échantillon précédemment préparé auquel on ajoute
250 µl de solution de standard interne et 500 µl de réactif de
dérivatisation . Deux injections successives sont réalisées. On obtient,
pour le pic du THC et pour l'étalon interne les résultats suivants :

|Injection |Aire chromatographique |Aire chromatographique |
| |(THC) |(E.I) |
|N°1 |103500 |62350 |
|N°2 |98700 |58750 |

Calculer, pour chacune des injections, la concentration en THC dans
l'échantillon analysé. En déduire la valeur moyenne ainsi que le
pourcentage d'incertitude.

6°) Quantification de l'échantillon initial
A partir des données fournies pour la préparation de l'échantillon,
en déduire la concentration en THC par ml de sang analysé. Que peut-on en
conclure.

A méditer...


1°) Quantification de cannabinoïdes

1) Concentrations et facteur de dilution

|S mère |V prélevé |V total |S fille |f |C (µg/l) |
| |(ml) |(ml) | | | |
|S0 |10 |100 |S1 |0,1 |100 |
|S1 |25 |50 |S2 |0,5 |50 |
|S2 |10 |20 |S3 |0,5 |25 |
|S1 |10 |50 |S4 |0,2 |10 |
|S2 |5 |25 |S5 |0,2 |5 |

Facteur de dilution (f) = V prélevé / Vtotal

2) Solution d'étalon interne

Le facteur de dilution est égal à 0,2. La concentration dans la solution
fille est égale à 20 mg/l.

3) Etalonnage interne

3-a mi = ki Ai et mEI = kEI AEI soit : mi / mEI = (ki /
kEI)* (Ai / AEI ) = m°i / m°EI
Soit :
m°i = / m°EI * {(ki / kEI)* (Ai / AEI )}

Expression dans laquelle: m°i représente la masse de THC présente dans le
vial, ki le facteur de réponse chromatographique du THC, m°EI la masse
d'étalon interne présente dans le vial, kEI le facteur de réponse de
l'étalon interne (E .I), Ai l'aire du pic chromatographique du THC et AEI
l'aire chromatographique du pic de l'étalon interne.
m°EI est une constante pour tous les essais et les différents volumes
étant constant dans toutes les expérimentations, on peut confondre les
masses et les concentrations (à un facteur près), ki et kEI sont des
constantes, on peut donc écrire,
m°i = Ki/EI * (Ai / AEI ) et en divisant par V:
C°i = K'i/EI* (Ai / AEI )

Il existe donc une relation linéaire entre la concentration en THC dans les
différents échantillons et le rapport des aires chromatographiques des pics
du THC et de celui de l'étalon interne. Ce qui conduit au tableau suivant :


|Echantillo|Aire (THC) |Aire (E.I) |CTHC (ng / ml)|Ai / AEI |
|n | | | | |
|E |13000 |62000 |5 |0,210 |
|D |29650 |61350 |10 |0,483 |
|C |60150 |59580 |25 |1,010 |
|B |127500 |64300 |50 |1,983 |
|A |253500 |57540 |100 |4,406 |



Ce qui conduit à la droite : CTHC = 22,812 (Ai / AEI) + 1,0854 r²
= 99,63 % (voir page suivante).

En chromatographie gazeuse sur colonnaire capillaire, les
quantités injectées sont faibles, aussi on utilise un diviseur (Split)
d'injection (seulement une partie de la quantité injectée est dirigée vers
la colonne chromatographique, le reste part à l'évent). Le